流式細(xì)胞術(shù)介紹及實(shí)驗(yàn)常見問題

　　流式細(xì)胞術(shù)廣泛應(yīng)用于細(xì)胞表面和細(xì)胞內(nèi)分子表達(dá)特征的分析，界定不同種類的細(xì)胞群，測定分離出的亞類純度，分析細(xì)胞的大小和總量，它可以同時分析單個細(xì)胞的多個參數(shù)。它主要用于檢測標(biāo)記在抗體上的熒光強(qiáng)度，這些熒光抗體則可以檢測與特定細(xì)胞分子結(jié)合的蛋白或配體，如與 DNA 結(jié)合的溴化丙啶 (PI)等。

　　染色步驟包括：將培養(yǎng)的細(xì)胞或組織樣品制成單細(xì)胞懸液，然后將細(xì)胞放入管子或酶標(biāo)板中與熒光標(biāo)記或未標(biāo)記的抗體孵育。之后將細(xì)胞放入流式細(xì)胞儀中進(jìn)行分析。

　　懸浮緩沖液中染色的細(xì)胞樣品通過流式細(xì)胞儀時，由于鞘液的作用被限制在液流的軸線上，從而通過一個非常小的噴嘴。這種微小的"流液束"使細(xì)胞一個接一個地通過激光，細(xì)胞/粒子通過通道時散射的光線被多個探測器檢測到。其中光柱前有一個檢測器（稱為前向角散射或簡稱 FSC），它的旁邊有幾個檢測器（稱為側(cè)向散射或簡稱 SSC）。熒光檢測器用于檢測熒光染料本身。粒子/細(xì)胞通過光束時，將出現(xiàn)光線散射，散射會通過前向散射和側(cè)向散射被檢測到。散射和熒光數(shù)據(jù)會結(jié)合起來分析。其中前向角散射光與細(xì)胞的大小有關(guān)；而側(cè)向角散射則依賴于粒子/細(xì)胞的密度（比如胞漿顆粒數(shù)量，細(xì)胞膜尺寸），并往往以這種方式，根據(jù)不同的大小和密度的差異而將細(xì)胞群區(qū)分開來。當(dāng)由相應(yīng)激發(fā)波長的激光激發(fā)時，用于檢測或染色的熒光染料就會發(fā)光。這些粒子/細(xì)胞就可分別被檢測并進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

　　直接染色：

　　直接免疫熒光染色時，細(xì)胞與直接結(jié)合有熒光染料（如 FITC 標(biāo)記）的抗體孵育。它的優(yōu)點(diǎn)在于只需要抗體孵育這一個步驟，從而消除了來自二抗的非特異性結(jié)合的可能性。這對細(xì)胞內(nèi)染色特別有用，由于大的抗體熒光分子復(fù)合物包括二抗被困在細(xì)胞內(nèi)造成背景，或甚至無法進(jìn)入細(xì)胞，阻止了一抗的檢測。

　　間接染色：

　　間接染色時，一抗不是熒光染料直接標(biāo)記的，而是通過熒光染料標(biāo)記的二抗檢測。另外可選擇使用親和-生物素系統(tǒng)，即抗體與生物素結(jié)合并且通過熒光染料標(biāo)記的親和素來檢測。隨著標(biāo)記二抗越來越多的應(yīng)用，可針對不同的目標(biāo)蛋白制出未標(biāo)記的一抗，然后用標(biāo)記二抗進(jìn)行流式細(xì)胞儀分析，這拓寬了研究者對目標(biāo)蛋白的選擇范圍。

　　細(xì)胞內(nèi)染色：

　　應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)的細(xì)胞內(nèi)源性抗原在染色時，應(yīng)采取各種不同的固定和通透方法，以使抗體能接近胞內(nèi)蛋白。

　　任何情況下，要獲得成功的染色都必須對實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)行優(yōu)化，包括測定抗體效價，采用合適的對照設(shè)定流式細(xì)胞儀，并且（如有必要）優(yōu)化樣品的固定和通透方法。

　　選擇熒光結(jié)合染料

　　對一個給定的抗體，從陰性中分辨出陽性細(xì)胞的能力，往往取決于所用的熒光結(jié)合染料。

　　各種熒光染料相對強(qiáng)度的一般準(zhǔn)則是，從zui亮到zui暗，PE（藻紅蛋白），PE-Cy7，PE-Cy5，APC > APC- Cy7，Alexa Fluor 47，Alexa Fluor 700 > FITC，Pacifi c Blue，Alexa Fluor 488。這是使用信噪比的一般模式，但對于個別抗體仍有些差異。

　　一個高表達(dá)的抗原通?？梢员粠缀跛械臒晒鈭F(tuán)分辨。一個低強(qiáng)度表達(dá)的抗原可能需要使用較亮的 PE 或APC，提信噪比，把未染色細(xì)胞中足夠分離出陽性細(xì)胞。

　　熒光染料強(qiáng)度的相對差異取決于儀器，這是因?yàn)樵诓煌膬x器上激光和過濾器的組合差異。一定要使用適當(dāng)?shù)腇ACS。

　　流式細(xì)胞術(shù)常見問題分析

　　無信號/熒光強(qiáng)度弱

　　不正確的信號補(bǔ)償

　　檢查流式細(xì)胞儀陽性單一顏色對照是否正確，通道和補(bǔ)償設(shè)置是否能正確地捕獲所有粒子。

　　沒有足夠的抗體來檢測

　　增加抗體的量/濃度

　　無法接近細(xì)胞內(nèi)目標(biāo)

　　檢查目標(biāo)蛋白是否在細(xì)胞內(nèi)。對于胞內(nèi)染色，確保有足夠的通透性。為防止細(xì)胞表面蛋白質(zhì)的內(nèi)化，該過程應(yīng)用冰冷的試劑，在冰上或 4 °C進(jìn)行，以終止一切反應(yīng)。加入疊氮鈉可防止表面抗原的修飾和內(nèi)化帶來的熒光強(qiáng)度的損失。對于細(xì)胞系染色，胰蛋白酶可以引起細(xì)胞表面蛋白質(zhì)的內(nèi)化，尤其是細(xì)胞表面分子，可能需要更溫和的分離方法。

　　細(xì)胞內(nèi)染色結(jié)合熒光分子太大

　　對細(xì)胞內(nèi)染色實(shí)驗(yàn)，熒光分子應(yīng)具有較小的分子量。大分子量熒光染料會降低抗體的動力和其進(jìn)入細(xì)胞的可能性。

　　激光器未對齊

　　確保流式細(xì)胞儀的激光器正確對齊，必要時通過運(yùn)行液流檢查微球來調(diào)整路線。如果激光器不能正確對準(zhǔn)或發(fā)生漂移時，您可能需要考慮此機(jī)的客服。

　　目標(biāo)蛋白不存在或處于低水平表達(dá)，確保組織或細(xì)胞類型表達(dá)的目標(biāo)蛋白處于一個足夠檢測的量。

　　可溶性或分泌型目標(biāo)蛋白

　　目標(biāo)蛋白是否可溶并從細(xì)胞內(nèi)分泌？需要嵌合在細(xì)胞膜上或存在于細(xì)胞質(zhì)里以便流式細(xì)胞儀能很容易檢測到。通過高爾基體封閉的步驟，比如加入 Brefaldin A，可提高細(xì)胞內(nèi)染色信號。

　　補(bǔ)償過高或增益過低

　　使用陽性對照再次設(shè)置流式細(xì)胞儀，利用補(bǔ)償以確保細(xì)胞的熒光信號不被切斷，提高增益以增強(qiáng)信號（在合理的范圍內(nèi)）。

　　熒光分子的熒光逐漸消退，抗體可能放置時間太長或沒有避光，新鮮抗體是必需的。

　　一抗和二抗不匹配

　　二抗應(yīng)該是和一抗來源物種相同（例如*抗體來源于兔，就要使用抗兔的第二抗體）。

　　熒光強(qiáng)度過高

　　抗體濃度過高

　　這將導(dǎo)致較高的非特異性結(jié)合或非常高的熒光強(qiáng)度。減少每個樣本中加入的抗體量。

　　過量抗體被困

　　這是細(xì)胞內(nèi)染色特有的問題，較大的熒光分子使抗體被困在細(xì)胞中。確保洗滌步驟充分，包括在洗滌緩沖液中加入吐溫或 Triton。

　　封閉不足

　　與封閉步驟一樣，抗體中加入1-3% 封閉試劑。

　　背景高或陽性細(xì)胞百分比高

　　增益設(shè)置過高或補(bǔ)償過低

　　使用陽性對照再次設(shè)置流式細(xì)胞儀，用補(bǔ)償減少小顆粒背景并減少增益以降低信號。

　　抗體過量

　　降低抗體濃度。您還可以在洗滌緩沖液中添加去污劑，以確保洗去多余的抗體。觀察到兩個或多個細(xì)胞群但應(yīng)該只有一群細(xì)胞不止一類細(xì)胞表達(dá)目的蛋白檢查樣品中所有細(xì)胞類型的預(yù)期表達(dá)水平，如果必要確保細(xì)胞充分分離。

　　出現(xiàn)細(xì)胞雙峰

　　細(xì)胞雙峰在圖上顯示兩倍的熒光強(qiáng)度的第二種細(xì)胞類型。染色前輕輕地混合細(xì)胞，在放入流式細(xì)胞儀前用吸管再次混勻，也可以篩選或過濾細(xì)胞以除去團(tuán)塊（30 μm 的尼龍網(wǎng)）。

　　側(cè)向散射背景偏高（來自小顆粒）

　　細(xì)胞裂解

　　確保樣品中細(xì)胞沒有裂解和破裂。樣品應(yīng)是新鮮的并且是正確制備的。細(xì)胞不能高轉(zhuǎn)速離心或劇烈震蕩。

　　細(xì)菌污染

　　確保樣品不受污染。細(xì)菌會低水平自發(fā)熒光，這也會導(dǎo)致高粒子率。

　　低粒子率

　　每毫升的細(xì)胞數(shù)量太少 制備 1 × 10 6 個細(xì)胞/ml。確保細(xì)胞充分混合（操作要輕）。

　　細(xì)胞聚集，阻塞管道

　　染色前輕輕吹打幾次確保形成同源單細(xì)胞懸液。確保運(yùn)行之前再次混勻。在的情況下，可篩選或過濾細(xì)胞以去除團(tuán)塊（30 μm 的尼龍網(wǎng)）。