人熱休克蛋白90(HSP90)ELISA試劑盒使用說明書

人熱休克蛋白90(HSP90)ELISA試劑盒實驗原理
本實驗采用雙抗體夾心ABC-ELISA法。用抗人HSP90單抗包被于酶標板上，標準品和樣品中的HSP90與單抗結合，加入生物素化的抗人HSP90，形成免疫復合物連接在板上，辣根過氧化物酶標記的Streptavidin與生物素結合，加入底物工作液顯藍色，最后加終止液硫酸，在450nm處測OD值，HSP90濃度與OD值成正比，可通過繪制標準曲線求出標本中HSP90濃度。

試劑盒組成（2-8℃保存）
酶標板（CoatedWells）    96孔    酶標抗體工作液（EnzymeConjugate）    12ml
10×標本稀釋液（SampleBuffer）    12ml    20×濃縮洗滌液（WashBuffer）    50ml
標準品（Standards）：8ng/瓶    2瓶    底物工作液（TMBSolution）    12ml
第一抗體工作液（BiotinylatedAntibody）    12ml    終止液（StopSolution）    12ml

準備試劑與收集血樣
1.收集標本：血清、血漿（EDTA）、細胞培養(yǎng)上清液、組織勻漿等裂解產物盡早檢測，2-8℃保存48小時；更長時間須冷凍（-20℃或-70℃）保存，避免反復凍融。
2.標準品液配制：使用前加入0.5ml蒸餾水混勻，配成16000pg/ml的溶液。設標準管8管，每管加入標本稀釋液200ul。在第一管中加入16000pg/ml的標準品溶液200ul混勻后用加樣器吸出200ul，移至第二管。如此反復作對倍稀釋，從第七管中吸出200ul棄去。第八管為空白對照。
3.10×標本稀釋液用蒸餾水作1:10倍稀釋（示例：1ml濃稀釋液+9ml蒸餾水）。
4.洗滌液：用重蒸水1:20稀釋（示例：1ml濃縮洗滌液加入19ml的重蒸水）

標本激活方法
1.將450ul標本稀釋液加入到一支1.5ml進口聚丙烯管中,再加10ul血清或血漿標本。
2.加20ul1NHCI,蓋緊，上下混勻。2－8℃放置60±2分鐘。
3.加20ul1NNaOH,蓋緊，上下混勻。
4.即用，或放-20/-70℃保存3天。計算結果時乘以稀釋倍數(shù)50。（注意：不同的標本HSP90的水平可能有較大差異，請根據實際情況靈活掌握稀釋度）
5.細胞培養(yǎng)上清或組織勻漿10倍稀釋(410ul的標本稀釋液＋50ul樣本＋20ul的1NHCI+20ul的1NNaOH)。

檢測程序
1.加樣：每孔各加入標準品或待測樣品（已激活）100ul，將反應板充分混勻后置37℃120分鐘。
2.洗板：用洗滌液將反應板充分洗滌4-6次，向濾紙上印干。
3.每孔中加入第一抗體工作液100ul。將反應板充分混勻后置37℃60分鐘。
4.洗板：同前。
5.每孔加酶標抗體工作液100ul。將反應板置37℃30分鐘。
6.洗板：同前。
7.每孔加入底物工作液100ul，置37℃暗處反應15分鐘。
8.每孔加入100ul終止液混勻。
9.30分鐘內用酶標儀在450nm處測吸光值。

結果計算與判斷
1.所有OD值都應減除空白值后再行計算。
2.以標準品8000、4000、2000、1000、500、250、125、0pg/ml為橫坐標，OD值為縱坐標，在坐標紙上作圖，畫出標準曲線。
3.根據樣品OD值在該曲線圖上查出相應HSP90含量，再乘上稀釋倍數(shù)即可。

試劑盒性能
1.靈敏度：最小的HSP90檢測濃度小于65pg/ml。
2.特異性：可同時檢測重組或天然的人HSP90。不與人其它細胞因子有交叉反應。
3.重復性：板內、板見變異系數(shù)均小于12％。

注意事項
1.以上標準孔及待測樣品均建議做復孔，每次測定應同時做標準曲線。
2.洗滌過程很關鍵。洗滌不充分將導致精確度誤差及OD值錯誤地升高。
3.板條開封后剩余板條要再封好，保持板條干燥。
4.本試劑盒宜置4oC冰箱保存。
5.本試劑盒僅用于科研，不能用于臨床診斷！