人胃蛋白酶(Pepsin)ELISA試劑盒實驗步驟

人胃蛋白酶(Pepsin)ELISA試劑盒使用前仔細閱讀本說明書。
本酶聯(lián)免疫試劑盒是基于雙抗體夾心技術原理，來檢測人胃蛋白酶(Pepsin)，只能用于研究用途，不得用于醫(yī)學診斷。
用途：用于人血清、血漿及相關液體樣本中胃蛋白酶(Pepsin)測定。

工作原理
本試劑盒采用的是生物素雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）測定樣品中人胃蛋白酶(Pepsin)水平。向預先包被了人胃蛋白酶(Pepsin)單克隆抗體的酶標孔中加入人胃蛋白酶(Pepsin)，溫育；溫育后，加入生物素標記的抗胃蛋白酶(Pepsin)抗體。再與鏈霉親和素-HRP結合，形成免疫復合物，再經(jīng)過溫育和洗滌，去除未結合的酶，然后加入底物A、B，產(chǎn)生藍色，并在酸的作用下轉化成最終的黃色。顏色的深淺與樣品中人胃蛋白酶(Pepsin)的濃度呈正相關。

試劑盒組成
試劑盒組成48孔配置96孔配置保存
說明書1份1份
封板膜2片（48）2片（96）
密封袋1個1個
酶標包被板1×481×962-8℃保存
標準品400ng/ml0.5ml×1瓶0.5ml×1瓶2-8℃保存
標準品稀釋液3ml×1瓶6ml×1瓶2-8℃保存
鏈霉親和素-HRP3 ml×1瓶6 ml×1瓶2-8℃保存
生物素標記的抗PEPSIN抗體0.5ml×1瓶1 ml×1瓶2-8℃保存
顯色劑A液3 ml×1瓶6 ml×1瓶2-8℃保存
顯色劑B液3 ml×1瓶6 ml×1瓶2-8℃保存
終止液3ml×1瓶6ml×1瓶2-8℃保存
濃縮洗滌液（20ml×20倍）×1瓶（20ml×30倍）×1瓶2-8℃保存

需要而未提供的試劑和器材
?37℃恒溫箱。
?標準規(guī)格酶標儀。
?精密移液器及一次性吸頭
?蒸餾水，
?一次性試管
?吸水紙
 
注意事項
?從2-8℃取出的試劑盒，在開啟試劑盒之前要室溫平衡至少30分鐘。酶標包被板開封后如未用完，板條應裝入密封袋中保存。
?各步加樣均應使用加樣器，并經(jīng)常校對其準確性，以避免試驗誤差
?嚴格按照說明書的操作進行，試驗結果判定必須以酶標儀讀數(shù)為準.
?為避免交叉污染，要避免重復使用手中的吸頭和封板膜。
?不用的其它試劑應包裝好或蓋好。不同批號的試劑不要混用。保質前使用。
?底物B對光敏感，避免長時間暴露于光下。
 
洗板方法
手工洗板方法：甩掉酶標板內的液體；在實驗臺上鋪墊幾層吸水紙，酶標板朝下用力拍幾次；將稀釋后的洗滌液至少0.35ml注入孔內，浸泡1-2分鐘。根據(jù)需要，重復此過程數(shù)次。
自動洗板：如果有自動洗板機，應在熟練使用后再用到正式實驗過程中

標本要求
1．不能檢測含NaN3的樣品，因NaN3抑制辣根過氧化物酶的（HRP）活性。
2．標本采集后盡早進行提取，提取按相關文獻進行，提取后應盡快進行實驗。若不能馬上進行試驗，可將標本放于-20℃保存，但應避免反復凍融。

操作程序
?標準品的稀釋：(本試劑盒提供原倍標準品一支，用戶可按照下列圖表在小試管中進行稀釋。)
200ng/ml5號標準品120μl的原倍標準品加入120μl標準品稀釋液
100ng/ml4號標準品120μl的5號標準品加入120μl標準品稀釋液
50ng/ml3號標準品120μl的4號標準品加入120μl標準品稀釋液
25ng/ml2號標準品120μl的3號標準品加入120μl標準品稀釋液
12.5ng/ml1號標準品120μl的2號標準品加入120μl標準品稀釋液
 
?根據(jù)代測樣品數(shù)量加上標準品的數(shù)量決定所需的板條數(shù)。每個標準品和空白孔建議做復孔。每個樣品根據(jù)自己的數(shù)量來定，能使用復孔的盡量做復孔。
?加樣：1）空白孔，空白對照孔不加樣品，生物素標記的抗PEPSIN抗體，鏈霉親和素-HRP，只加顯色劑A&B和終止液，其余各步操作相同；2）標準品孔：加入標準品50ul，鏈霉親和素-HRP50ul(標準品中已事先整合好生物素抗體，故不加)；3）代測樣品孔：加入樣本40ul，然后各加入抗PEPSIN抗體10ul、鏈霉親和素-HRP50ul，蓋上封板膜，輕輕震蕩混勻，37℃溫育60分鐘。
?配液：將30倍濃縮洗滌液用蒸餾水30倍稀釋后備用。
?洗滌：小心揭掉封板膜，棄去液體，甩干，每孔加滿洗滌液，靜置30秒后棄去，如此重復5次，拍干。
?顯色：每孔先加入顯色劑A50ul，再加入顯色劑B50μl，輕輕震蕩混勻，37℃避光顯色15分鐘.
?終止：每孔加終止液50μl，終止反應（此時藍色立轉黃色）。
?測定：以空白空調零，450nm波長依序測量各孔的吸光度（OD值）。 測定應在加終止液后10分鐘以內進行。
?根據(jù)標準品的濃度及對應的OD值計算出標準曲線的直線回歸方程，再根據(jù)樣品的OD值在回歸方程上計算出對應的樣品濃度。也可以使用各種應用軟件來計算。

試劑盒性能：
1.樣品線性回歸與預期濃度相關系數(shù)R值為0.92以上。
2.批內與批間應分別小于9%和15%

檢測范圍：6ng/ml -200ng/ml
保存：2-8℃。
有效期：6個月(2-8℃)。