人激肽釋放酶8(KLK 8)ELISA試劑盒實(shí)驗(yàn)原理

人激肽釋放酶8(KLK 8)ELISA試劑盒僅供科研實(shí)驗(yàn)使用！

本試劑盒采用夾心法酶聯(lián)免疫吸附法,用于體外定量分析人血清、血漿、細(xì)胞裂解液、細(xì)胞培養(yǎng)上清中Kallikrein-8的含量。

檢測(cè)原理:
預(yù)先包被的抗體和檢測(cè)相抗體都是親和純化的Kallikrein-8多克隆抗體。檢測(cè)相抗體經(jīng)生物素標(biāo)記。樣品和生物素標(biāo)記抗體先后加入酶標(biāo)板孔反應(yīng)后,PBS或TBS洗滌。隨后加入過(guò)氧化物酶標(biāo)記的親和素反應(yīng);經(jīng)過(guò)PBS或TBS的 洗滌后用底物TMB顯色。TMB在過(guò)氧化物酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍(lán)色,并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成最終的黃色。顏色的深淺和樣品中的Kallikrein-8呈正相關(guān)。

背景資料:
激肽釋放酶(kallikrein)基因家族是編碼絲氨酸蛋白酶的一組同源基因,串連排列在19q1314染色體上,包括KLK1~KLK15,它們都參與血 管張力與通透性的維持,各種生長(zhǎng)因子的裂解和激活,調(diào) 節(jié)神 經(jīng)系統(tǒng)可塑性以及皮膚表面細(xì)胞脫落與再生等眾多生理過(guò)程。

基本參數(shù):
檢測(cè)指標(biāo):Kallikrein-8;KLK8
檢測(cè)范圍:156pg/ml~10000pg/ml
特異性:系統(tǒng)和其它細(xì)胞因子無(wú)交叉反應(yīng)
敏感性:<5pg/ml

產(chǎn)品組成:
組分     規(guī)格     數(shù)量
預(yù)包被抗人Kallikrein-8抗體的96孔板     96T     1板
重組人Kallikrein-8標(biāo)準(zhǔn)品(凍干)     10ng/管     2管
生物素標(biāo)記抗人Kallikrein-8(100X)     100μL     1管
親和素-過(guò)氧化物酶復(fù)合物(ABC)(100X)     100μL     1管
樣品稀釋液     30mL     1瓶
抗體稀釋液     12mL     1瓶
ABC稀釋液     12mL     1瓶
TMB顯色液     10mL     1瓶
終止液     10mL     1瓶
洗滌緩沖液(25X)     20mL     1瓶
封板膜         4張
保存:2~8℃,有效期6個(gè)月。長(zhǎng)期不用請(qǐng)置于-20℃可保存1年。

自備器材:
標(biāo)準(zhǔn)規(guī)格酶標(biāo)儀。
自動(dòng)洗板機(jī)。
恒溫箱
系列可調(diào)節(jié)移液器及吸頭,一次檢測(cè)樣品較多時(shí), 用多通道移液器。
干凈的試管和Eppendof管。
用去離子水將25X洗滌緩沖液稀釋25倍,成1X洗滌緩沖液。

注意事項(xiàng):
使用前TMB顯色液應(yīng)為無(wú)色透明溶液,若發(fā)現(xiàn)顏色異常,請(qǐng)及時(shí)與我司聯(lián)系。
用戶在初次使用試劑盒時(shí),應(yīng)將各種試劑管離心數(shù)分鐘,以便試劑集中到管底。
要嚴(yán)格避免操作過(guò)程中酶標(biāo)板干燥。干燥會(huì)使酶標(biāo)板上生物成份迅速失活。
為免交叉污染,要避免重復(fù)使用手中的吸頭和試管。
禁止混用不同批次試劑盒內(nèi)的試劑。
本公司提供的96孔酶標(biāo)板是單條可拆型酶標(biāo)板,用戶可按需求使用;剩余的酶標(biāo)板請(qǐng)按保存條件貯存。
揭封板膜和覆蓋封板膜時(shí)應(yīng)避免用力過(guò)大導(dǎo)致液體濺出。

洗板方法:
手工洗板方法:吸去(不可觸及板壁)或甩掉酶標(biāo)板內(nèi)的液體;在實(shí)驗(yàn)臺(tái)上鋪墊幾層吸水紙,酶標(biāo)板朝下用力拍幾次;將1X洗滌緩沖液至少300μL注入孔內(nèi),浸泡1~2分鐘。根據(jù)需要,重復(fù)此過(guò)程數(shù)次。
自動(dòng)洗板:如果有自動(dòng)洗板機(jī),應(yīng)在熟練使用后再用到正式實(shí)驗(yàn)過(guò)程中。

樣品準(zhǔn)備:
樣品如果不立即分析,應(yīng)分裝后冷凍保存,且避免反復(fù)凍融。
細(xì)胞培養(yǎng)上清:離心去除沉淀,立即分析或分裝后-20℃冷凍保存。
血清:用干凈試管收集血液,室溫凝固30分鐘,離心1000×g 15分鐘,收集血清。立即分析或分裝后-20℃冷凍保存。
血漿:采用肝素或EDTA抗凝,抽血后30分鐘內(nèi)離心1000×g 15分鐘。立即分析或分裝后-20℃冷凍保存。
貼壁細(xì)胞:去除培養(yǎng)液,用PBS、生理鹽水或無(wú)血清培養(yǎng)液洗一遍。加入適量裂解液,用槍吹打數(shù)下,使裂解液和細(xì)胞充分接觸。通常10秒后,細(xì)胞就會(huì)被裂解。
懸浮細(xì)胞:離心收集細(xì)胞,用PBS、生理鹽水或無(wú)血清培養(yǎng)液洗一遍。加入適量裂解液,用槍吹打把細(xì)胞吹散,用手指輕彈以充分裂解細(xì)胞。充分裂解后,10000~14000g離心3~5分鐘,取上清。立即分析或分裝后-20℃冷凍保存。

樣品稀釋:
用戶須估計(jì)樣品待測(cè)因子的含量,決定適當(dāng)?shù)南♂尡稊?shù),以使稀釋后樣品中待測(cè)因子的濃度處于ELISA試劑盒的 檢測(cè)范圍。根據(jù)待測(cè)因子含量高、中、低的不同,分別采取不同的稀釋方案,以下方案僅供參考,樣品的稀釋應(yīng)有詳細(xì)記錄。
高:指待測(cè)因子在100~1000ng/ml。一般按1:100稀釋。297μL樣品稀釋液加3μL樣品。
中:指待測(cè)因子在10~100ng/ml。一般按1:10稀釋。225μL樣品稀釋液加25μL樣品。
低:指待測(cè)因子在156–10,000pg/ml。按1:2稀釋。100μL樣品稀釋液加100μL樣品。
特低:指待測(cè)因子≤156pg/ml。樣品一般不做稀釋,或按1:2稀釋。

試劑準(zhǔn)備:
KLK8標(biāo)準(zhǔn)品的稀釋和使用:在使用前2小時(shí)內(nèi)準(zhǔn)備。試劑盒提供2管標(biāo)準(zhǔn)品,每管10ng,每次使用1管。
配制10,000pg/ml標(biāo)準(zhǔn)品:取1mL樣品稀釋液加入標(biāo)準(zhǔn)品管內(nèi),蓋好后靜置10分鐘以上,然后反復(fù)顛倒/搓動(dòng)以助溶解。
配制5000pg/ml~156pg/ml標(biāo)準(zhǔn)品:準(zhǔn)備6只Eppendorf管,每管加0.3mL樣品稀釋液,分別標(biāo)記上5000pg/ml,2500pg/ml,1250pg/ml,625pg/ml,312pg/ml,156pg/ml。取0.3mL 10,000pg/ml的標(biāo)準(zhǔn)品加入標(biāo)記5000pg/ml的管中,混勻后同樣取出0.3mL,加入下一只管中。余同此類推,直到 一只樣品管。
注意:已經(jīng)稀釋的標(biāo)準(zhǔn)品(10,000pg/ml),應(yīng)在12小時(shí)內(nèi)使用。-20℃冷凍保存條件下,2天內(nèi)可以使用,但不得反復(fù)凍融。
生物素標(biāo)記抗人KLK8抗體工作液的準(zhǔn)備:在使用前2小時(shí)內(nèi)準(zhǔn)備。
根據(jù)每孔需要100μL計(jì)算總的用量(實(shí)際配制時(shí)應(yīng)多配制100~200μL)。
按1μL生物素標(biāo)記抗人KLK8加抗體稀釋液99μL的比例配制工作液。輕輕混勻。
親和素-過(guò)氧化物酶復(fù)合物(ABC)工作液的準(zhǔn)備:在使用前1小時(shí)內(nèi)準(zhǔn)備。
根據(jù)每孔需要100μL計(jì)算總的用量(實(shí)配時(shí)應(yīng)多配制100~200μL)。
按1μL親和素-過(guò)氧化物酶復(fù)合物(ABC)加ABC稀釋液99μL的比例配制工作液。輕輕混勻。
注意:已稀釋好的ABC應(yīng)預(yù)先在37℃中平衡至少30分鐘后加入孔內(nèi)。

操作程序:
已稀釋好的ABC和TMB顯色液在加入酶標(biāo)板孔前都應(yīng)預(yù)先在37℃中平衡至少30分鐘。試劑或樣品稀釋時(shí),切不可忘記混勻。每次檢測(cè)都應(yīng)該做標(biāo)準(zhǔn)曲線。用戶須估計(jì)樣品待測(cè)因子的含量,決定適當(dāng)?shù)南♂尡稊?shù)。
確定本次檢測(cè)所需的已包被抗體的酶標(biāo)板孔數(shù)目,并增加1孔作為TMB空白顯色孔?？倲?shù)=樣品數(shù)+9;做雙份檢測(cè)時(shí)×2。其余重包裝好放入冰箱中。
將10,000pg/ml,5000pg/ml,2500pg/ml,1250pg/ml,625pg/ml,312pg/ml,156pg/ml的標(biāo)準(zhǔn)品各100μL依次加入一排7孔中,1孔只加樣品稀釋液的作為零孔。對(duì)于人血清、血漿、細(xì)胞裂解液、細(xì)胞培養(yǎng)上清,直接加已用樣品稀釋液稀釋的樣品100μL。
酶標(biāo)板加上封板膜,37℃反應(yīng)90分鐘。
反應(yīng)后用自動(dòng)洗板機(jī)吸去酶標(biāo)板內(nèi)的液體;或甩去酶標(biāo)板內(nèi)液體,再對(duì)著吸水紙拍幾下。不洗。
將準(zhǔn)備好的生物素抗人KLK8抗體工作液按每孔100μL依次加入。(TMB空白顯色孔除外)。
酶標(biāo)板加上封板膜,37℃反應(yīng)60分鐘。
1X洗滌緩沖液洗滌3次,每次浸泡1分鐘左右(每孔洗液至少300μL)。
將準(zhǔn)備好的ABC工作液按每孔100μL依次加入(TMB空白顯色孔除外)。
酶標(biāo)板加上封板膜,37℃反應(yīng)30分鐘。
1X洗滌緩沖液洗滌5次,每次浸泡1~2分鐘左右(每孔洗液至少300μL)。
按每孔90μL依次加入已在37℃平衡30分鐘的TMB顯色液,37℃避光反應(yīng)15~20分鐘。
注意:顯色時(shí)間供參考,因用戶實(shí)驗(yàn)室條件差異, 顯色時(shí)間會(huì)有所不同。此時(shí)肉眼可見(jiàn)標(biāo)準(zhǔn)品的前3~4孔有明顯的梯度藍(lán)色,后3~4孔差別不明顯。
按每孔100μL依次加入終止液,此時(shí)藍(lán)色立轉(zhuǎn)黃色。
用酶標(biāo)儀在450nm測(cè)定O.D.值。
有兩種設(shè)定空白對(duì)照的方案:
① 將TMB空白顯色孔(只加TMB顯色液和終止液)設(shè)為對(duì)照。所有的標(biāo)準(zhǔn)品和樣品的吸光值減去TMB空白顯色孔的吸光值后,在坐標(biāo)紙上畫出曲線,以吸光值作為縱坐標(biāo),以濃度作為橫坐標(biāo)。
② 將零孔設(shè)為對(duì)照。所有的標(biāo)準(zhǔn)品和樣品的吸光值減去零孔的吸光值后,得到的數(shù)據(jù)可以直接在坐標(biāo)紙上畫出曲線。
根據(jù)樣品的吸光值在坐標(biāo)上找出對(duì)應(yīng)的濃度。用戶也可以使用各種應(yīng)用軟件來(lái)計(jì)算。應(yīng)記住由于樣品稀釋了N倍,其實(shí)際濃度應(yīng)該×N。

操作總結(jié):
加樣品和標(biāo)準(zhǔn)品,37℃反應(yīng)90分鐘。不洗。
加生物素標(biāo)記抗體,37℃反應(yīng)60分鐘。1X洗滌緩沖液洗滌3次。
加ABC,37℃反應(yīng)30分鐘。1X洗滌緩沖液洗滌5次。
TMB 37℃反應(yīng)15~20分鐘。
加入終止液,讀數(shù)。

參考數(shù)據(jù):
取自某些批次質(zhì)檢數(shù)據(jù),僅供參考,用戶需要自己建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。
濃度(pg/ml)     0     156     312     625     1250     2500     5000     10000
OD值     0.002     0.115     0.221     0.408     0.692     1.106     1.755     2.485