人c-fos ELISA Kit使用說明書

人c fos ELISA Kit原理
本實驗采用雙抗體夾心 ABC-ELISA法。用抗人 C-Fos 單抗包被于酶標(biāo)板上，標(biāo)準(zhǔn)品和樣品中的 C-Fos與單抗結(jié)合，加入生物素化的抗人C-Fos，形成免疫復(fù)合物連接在板上，辣根過氧化物酶標(biāo)記的Streptavidin與生物素結(jié)合，加入底物工作液顯藍色，最后加終止液硫酸，在450nm處測OD值，C-Fos濃度與OD值成正比，可通過繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線求出標(biāo)本中C-Fos濃度。

試劑盒組成（2-8℃保存）
酶標(biāo)板（Coated Wells）    96孔    酶標(biāo)抗體工作液（Enzyme Conjugate）    12ml
10×標(biāo)本稀釋液（Sample Buffer）    12ml    20×濃縮洗滌液（Wash Buffer）    50ml
標(biāo)準(zhǔn)品（Standards）：1.6ng/瓶    2瓶    底物工作液（TMB Solution）    12ml
第一抗體工作液（Biotinylated Antibody）    12ml    終止液（Stop Solution）    12ml

準(zhǔn)備試劑與收集血樣
1.收集標(biāo)本：血清、血漿（EDTA）、細(xì)胞培養(yǎng)上清液、組織勻漿、尿液等盡早檢測，2-8℃保存48小時；更長時間須冷凍（-20 ℃或-70 ℃）保存，避免反復(fù)凍融。
2.標(biāo)準(zhǔn)品液配制：使用前加入0.4ml蒸餾水混勻，配成4000pg/ml的溶液。設(shè)標(biāo)準(zhǔn)管8管，每管加入標(biāo)本稀釋液200ul。在第一管中加入4000pg/ml的標(biāo)準(zhǔn)品溶液200ul混勻后用加樣器吸出200ul，移至第二管。如此反復(fù)作對倍稀釋，從第七管中吸出200ul棄去。第八管為空白對照。
3.10×標(biāo)本稀釋液用蒸餾水作1:10倍稀釋（示例：1ml濃稀釋液+9ml蒸餾水）。
4. 洗滌液：用重蒸水1:20稀釋（示例：1ml濃縮洗滌液加入19ml的重蒸水）

標(biāo)本激活方法
1.將450ul標(biāo)本稀釋液加入到一支1.5ml進口聚丙烯管中,再加10ul血清或血漿標(biāo)本。
2.加20ul 1 N HCI,蓋緊，上下混勻。2－8℃放置60± 2分鐘。
3.加20ul 1 N NaOH,蓋緊，上下混勻。
4.即用，或放-20/-70℃保存3天。計算結(jié)果時乘以稀釋倍數(shù)50。（注意：不同的標(biāo)本C-Fos的水平可能有較大差異，請根據(jù)實際情況靈活掌握稀釋度）
5.細(xì)胞培養(yǎng)上清或組織勻漿10倍稀釋(410ul的標(biāo)本稀釋液＋50ul樣本＋20ul的1N HCI+20ul的1N NaOH)。

檢測程序
1.加樣：每孔各加入標(biāo)準(zhǔn)品或待測樣品（已激活）100ul，將反應(yīng)板充分混勻后置37℃120分鐘。
2.洗板：用洗滌液將反應(yīng)板充分洗滌4-6次，向濾紙上印干。
3.每孔中加入第一抗體工作液100ul。將反應(yīng)板充分混勻后置37℃60分鐘。
4.洗板：同前。
5.每孔加酶標(biāo)抗體工作液100ul。將反應(yīng)板置37℃30分鐘。
6.洗板：同前。
7.每孔加入底物工作液100ul，置37 ℃暗處反應(yīng)15分鐘。
8.每孔加入100ul終止液混勻。
9.30分鐘內(nèi)用酶標(biāo)儀在450nm處測吸光值。

結(jié)果計算與判斷
1.所有OD值都應(yīng)減除空白值后再行計算。
2.以標(biāo)準(zhǔn)品2000、1000、500、250、125、62.5、31.2、0 pg/ml為橫坐標(biāo)，OD值為縱坐標(biāo)，在坐標(biāo)紙上作圖，畫出標(biāo)準(zhǔn)曲線。
3.根據(jù)樣品OD值在該曲線圖上查出相應(yīng)C-Fos含量，再乘上稀釋倍數(shù)即可。

試劑盒性能
1.靈敏度：最小的C-Fos 檢測濃度小于15pg/ml。
2.特異性：可同時檢測重組或天然的人C-Fos。不與人其它細(xì)胞因子有交叉反應(yīng)。
3.重復(fù)性：板內(nèi)、板見變異系數(shù)均小于8.9％。

注意事項
1.以上標(biāo)準(zhǔn)孔及待測樣品均建議做復(fù)孔，每次測定應(yīng)同時做標(biāo)準(zhǔn)曲線。
2.洗滌過程很關(guān)鍵。洗滌不充分將導(dǎo)致精確度誤差及OD值錯誤地升高。
3.板條開封后剩余板條要再封好，保持板條干燥。
4.本試劑盒宜置4oC冰箱保存。
5.本試劑盒僅用于科研，不能用于臨床診斷！