菌種在不同情況下的純化方法

菌種在分離、保藏和生產(chǎn)過程中，極易遭致雜菌污染，因此必須對(duì)染有雜菌的菌種進(jìn)行提純，方能用于生產(chǎn)。根據(jù)污染的類型和程度，需采用不同的純化措施。

（1）排除細(xì)菌或酵母菌污染

在菌種培養(yǎng)中，用肉眼仔細(xì)觀察培養(yǎng)基表面，不難發(fā)現(xiàn)被細(xì)菌或酵母菌污染的分離物常出現(xiàn)黏稠狀的菌落。取被純化物接種在無冷凝水、硬度較高（瓊脂用量2.3%～2.5%）的斜面上，再降低培養(yǎng)溫度至15～20℃，利用某些大型真菌在較低的溫度下，菌絲生長(zhǎng)速度比細(xì)菌蔓延速度快的特點(diǎn)，用尖細(xì)的接種針切割菌絲的前端，轉(zhuǎn)接到新的試管斜面培養(yǎng)基中培養(yǎng)，連續(xù)2～3次就能獲得所要的純菌絲。也可打破試管，挑取內(nèi)部長(zhǎng)有基內(nèi)菌絲的瓊脂塊，移入無冷凝水的培養(yǎng)基上，該法適于被好氣性細(xì)菌污染的母種。

（2）排除霉菌污染

霉菌和細(xì)菌不同，它和食用菌菌絲很相似，也有氣生菌絲和基內(nèi)菌絲。分離的方法主要是抑制雜菌生長(zhǎng)，拉大食用菌菌絲生長(zhǎng)和雜菌菌絲生長(zhǎng)的范圍差，從食用菌菌落前端切割，移植入新培養(yǎng)基。雜菌發(fā)現(xiàn)越早，分離的成功率越大。嚴(yán)格地說，在斜面培養(yǎng)基上的非接種部位發(fā)現(xiàn)的白色菌絲，應(yīng)認(rèn)為是雜菌菌落，應(yīng)馬上提純。若有色孢子已出現(xiàn)，一方面易使分生孢子飄散，另一方面其基內(nèi)菌絲早已蔓延，可能和食用菌菌絲混生一起。如霉菌剛出現(xiàn)孢子且尚未成熟、變色，則可采用前端菌絲切割法提純。轉(zhuǎn)管時(shí)先將菌絲接種在斜面尖端，當(dāng)長(zhǎng)滿斜面后，及時(shí)將原接種點(diǎn)連同培養(yǎng)基一起挖掉；如霉菌菌落顏色已深，說明孢子已成熟，稍一振動(dòng)孢子就會(huì)飄滿培養(yǎng)基，若再行上法意義不大。如菌絲蔓延范圍較大，可將0.2%升汞溶液或1%多菌靈處理過的濕濾紙塊覆蓋在霉菌的菌落上，可抑制霉菌生長(zhǎng)，防止孢子擴(kuò)散，后用滅菌接種鏟將表層鏟掉，隨之用接種針鉤取基內(nèi)菌絲移入新的培養(yǎng)基，如此2～3次。

（3）限制培養(yǎng)

取直徑7～10毫米、高4～6毫米的玻璃環(huán)或不銹鋼環(huán)，經(jīng)酒精燈火焰灼燒后趁熱放到斜面培養(yǎng)基中央，將環(huán)的一半嵌入培養(yǎng)基內(nèi)，然后將染有細(xì)菌的接種塊放入環(huán)內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)。細(xì)菌生長(zhǎng)會(huì)被限制在環(huán)內(nèi)，而食用菌菌絲則可越過環(huán)而長(zhǎng)到環(huán)外的培養(yǎng)基上，轉(zhuǎn)管后即可得到純化。

（4）覆蓋培養(yǎng)

在污染了細(xì)菌的食用菌菌絲斜面上傾注一層厚約2毫米的培養(yǎng)基，培養(yǎng)一段時(shí)間，當(dāng)食用菌菌絲透過培養(yǎng)基形成新的菌落時(shí)，即可切割轉(zhuǎn)管。最好進(jìn)行二次覆蓋。

（5）基質(zhì)菌絲純化培養(yǎng)

對(duì)棉塞長(zhǎng)有霉菌的試管斜面，可將試管打碎，取出培養(yǎng)基，用0.1%升汞浸泡2分鐘，用無菌水淋洗，再用無菌濾紙吸干。取一段2厘米的培養(yǎng)基從中部切開，在斷面上用無菌刀片切成米粒大小的塊，移入新的斜面上進(jìn)行培養(yǎng)。

（6）藥物處理

菌種提純時(shí)，可向培養(yǎng)基中注入選擇性強(qiáng)的抗菌制劑，如加入 5～10毫克/升的多菌靈（MBC）、涕必靈（TBZ）或托布津等，可有效地防止菌霉混生；在每毫升培養(yǎng)基中加入30～40毫克鏈霉素、20～30毫克四環(huán)素、金霉素，或50毫克高錳酸鉀，可以有效地防止細(xì)菌混生；加入灰黃霉素（20單位/毫升），可抑制真菌生長(zhǎng)。

（7）破碎菌絲

從試管中取出已污染的培養(yǎng)基，放在0.1%升汞水中處理2分鐘，用無菌水沖洗，無菌紙吸干，再放入有玻璃珠的無菌水內(nèi)，經(jīng)組織破碎，稀釋后注入平板培養(yǎng)，取其單個(gè)菌落純化培養(yǎng)。