紫外吸收法定量蛋白質(zhì)的優(yōu)缺點(diǎn)介紹

1．蛋白質(zhì)測(cè)定的Folin-酚比色法（即Lowry法）的定量范圍為5～100μg蛋白質(zhì)，靈敏度高；但操作要費(fèi)較長(zhǎng)時(shí)間，且Folin試劑顯色反應(yīng)由酪氨酸、色氨酸和半胱氨氨酸引起，因此樣品中若含有酚類、檸檬酸和巰基化合物均有干擾作用；不同蛋白質(zhì)因酪氨酸、色氨酸含量不同而使顯色強(qiáng)度也稍有不同。 紫外吸收法測(cè)蛋白質(zhì)含量迅速、簡(jiǎn)便、不消耗樣品，低濃度鹽類不干擾測(cè)定。因此，已在蛋白質(zhì)和酶的生化制備中廣泛采用，尤其在柱層析分離純化中，常用280nm進(jìn)行紫外檢測(cè)，來判斷蛋白質(zhì)吸附或洗脫情況。

但該法的缺點(diǎn)是：

（1）對(duì)于測(cè)定那些與標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)中酪氨酸和色氨酸含量差異較大的蛋白質(zhì)，有一定的誤差。故該法適于測(cè)定與標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)氨基酸組成相似的蛋白質(zhì)。

（2）若樣品中含有嘌呤、嘧啶等吸收紫外光的物質(zhì)，會(huì)出現(xiàn)較大干擾。例如，在制備酶的過程中，層析柱的流出液中有時(shí)混雜有核酸，應(yīng)予以校正

2．當(dāng)樣品中含有核酸類雜質(zhì)，可以根據(jù)核酸在260nm波長(zhǎng)處有最強(qiáng)的紫外光吸收，而蛋白質(zhì)在280nm處有最大的紫外光吸收的性質(zhì)，通過計(jì)算可以適當(dāng)校正核酸對(duì)于測(cè)定蛋白質(zhì)濃度的干擾作用。但是，因?yàn)椴煌牡鞍踪|(zhì)和核酸的紫外吸收是不相同的，雖然經(jīng)過校正，測(cè)定結(jié)果還存在著一定的誤差