人CX3C趨化因子受體1(CX3CR1)ELISA試劑盒實驗方法

中文名稱：人CX3C趨化因子受體1(CX3CR1)ELISA試劑盒
英文名稱：HumanCX3C-chemokinereceptor1,CX3CR1 ELISA Kit
規(guī)格：48T/96T
儲存溫度：-20℃(較長時間不用時)；2-8℃(頻繁使用時)

實驗原理
本試劑盒應(yīng)用雙抗體夾心法測定標本中指標水平。用純化的指標抗體包被微孔板,制成固相抗體,往包被單抗的微孔中依次加入指標,再與HRP標記的咖啡酸-O-甲基轉(zhuǎn)移酶(COMT)抗體結(jié)合,形成抗體-抗原-酶標抗體復(fù)合物,經(jīng)過 洗滌后加底物TMB顯色。TMB在HRP酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍色,并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成最終的黃色。顏色的深淺和樣品中的指標呈正相關(guān)。用酶標儀在450nm波長下測定吸光度(OD值),通過標準曲線計算樣品中指標濃度。

試劑盒內(nèi)容及其配制：
試劑盒成份    96孔配置    48孔配置
96/48人份酶標板    1塊板（96T）    半塊（48T）
塑料膜板蓋    1塊    半塊
標準品    1瓶（1.0ml）    1瓶（0.5ml）
空白對照    1瓶（1.0ml）    1瓶（0.5ml）
標準品稀釋緩沖液    1瓶（8.0ml）    1瓶（4.0ml）
生物素標記抗體    1瓶（8.0ml）    1瓶（4.0ml）
親和鏈酶素-HRP    1瓶（12ml）    1瓶（6.0ml）
洗滌緩沖液    1瓶（20ml）    1瓶（10ml）
底物A    1瓶（6.0ml）    1瓶（3.0ml）
底物B    1瓶（6.0ml）    1瓶（3.0ml）
終止液    1瓶（6.0ml）    1瓶（3.0ml）

自備材料：
1．蒸餾水。
2．加樣器：5ul、10ul、50ul、100ul、200、500ul、1000ul。
3．振蕩器及磁力攪拌器等。

人CX3C趨化因子受體1(CX3CR1)ELISA試劑盒樣品收集、處理及保存方法：
1、血清-----操作過程中避免任何細胞刺激。使用不含熱原和內(nèi)毒素的試管。收集血液后，1000×g離心10分鐘將血清和紅細胞迅速小心地分離。
2、血漿-----EDTA、檸檬酸鹽、肝素血漿可用于檢測。1000×g離心30分鐘去除顆粒。
3、細胞上清液---1000×g離心10分鐘除顆粒和聚合物。
4、組織勻漿-----將組織加入適量生理鹽水搗碎。1000×g離心10分鐘，取上清液
5、保存------如果樣品不立即使用，應(yīng)將其分成小部分-70 ℃保存，避免反復(fù)冷凍。盡可能的不要使用溶血或高血脂血。如果血清中大量顆粒，檢測前先離心或過濾。不要在37℃或更高的溫度加熱解凍。應(yīng)在室溫下解凍并確保樣品均勻地充分解凍。

操作注意事項：
? 試劑應(yīng)按標簽說明書儲存，使用前恢復(fù)到室溫。稀稀過后的標準品應(yīng)丟棄，不可保存。
? 實驗中不用的板條應(yīng)立即放回包裝袋中，密封保存，以免變質(zhì)。
? 不用的其它試劑應(yīng)包裝好或蓋好。不同批號的試劑不要混用。保質(zhì)前使用。
? 使用一次性的吸頭以免交叉污染，吸取終止液和底物A、B液時，避免使用帶金屬部分的加樣器。
? 使用干凈的塑料容器配置洗滌液。使用前充分混勻試劑盒里的各種成份及樣品。
? 底物A應(yīng)揮發(fā)，避免長時間打開蓋子。底物B對光敏感，避免長時間暴露于光下。避免用手接觸，有毒。實驗完成后應(yīng)立即讀取OD值。
? 加入試劑的順序應(yīng)一致，以保證所有反應(yīng)板孔溫育的時間一樣。
按照說明書中標明的時間、加液的量及順序進行溫育操作。

安全性：
1．避免直接接觸終止液和底物A、B。一旦接觸到這些液體，請盡快用水沖洗。
2．實驗中不要吃喝、抽煙或使用化妝品。
3．不要用嘴吸取試劑盒里的任何成份。

試劑盒性能：
1. 靈敏度：最小的檢測濃度小于1號標準品。稀釋度的線性。樣品線性回歸與預(yù)期濃度相關(guān)系數(shù)R值為0.990。
2. 特異性：不與其它細胞因子反應(yīng)。
3. 重復(fù)性：板內(nèi)、板間變異系數(shù)均小于10%。

操作步驟：
1．使用前，將所有試劑充分混勻。不要使液體產(chǎn)生大量的泡沫，以免加樣時加入大量的氣泡，產(chǎn)生加樣上的誤差。
2．根據(jù)待測樣品數(shù)量加上標準品的數(shù)量決定所需的板條數(shù)。每個標準品和空白孔建議做復(fù)孔。每個樣品根據(jù)自己的數(shù)量來定，能使用復(fù)孔的盡量做復(fù)孔。
3．加入稀釋好后的標準品50ul于反應(yīng)孔、加入待測樣品50ul于反應(yīng)孔內(nèi)。立即加入50ul的生物素標記的抗體。蓋上膜板，輕輕振蕩混勻，37℃溫育45分鐘。
4．甩去孔內(nèi)液體，每孔加滿洗滌液，振蕩30秒，甩去洗滌液，用吸水紙拍干。重復(fù)此操作4次。如果用洗板機洗滌，洗滌次數(shù)增加一次。
5．每孔加入100ul的親和鏈酶素-HRP，輕輕振蕩混勻，37℃溫育30分鐘。
6．甩去孔內(nèi)液體，每孔加滿洗滌液，振蕩30秒，甩去洗滌液，用吸水紙拍干。重復(fù)此操作4次。如果用洗板機洗滌，洗滌次數(shù)增加一次。
7．每孔加入底物A、B各50ul，輕輕振蕩混勻，37℃溫育5分鐘。避免光照。
8．取出酶標板，迅速加入50ul終止液，加入終止液后應(yīng)立即測定結(jié)果。
9．在450nm波長處測定各孔的OD值。

結(jié)果判斷與分析：
1、儀器值：于波長450nm的酶標儀上讀取各孔的OD值
2、以吸光度OD值為縱坐標（Y），相應(yīng)的指標標準品濃度為橫坐標（X），做得相應(yīng)的曲線，樣品的含量可根據(jù)其OD值由標準曲線換算出相應(yīng)的濃度, 再乘以稀釋倍數(shù)；或用標準物的濃度與OD值計算出標準曲線的回歸方程式，將樣品的OD值代入方程式，計算出樣品濃度，再乘以稀釋倍數(shù)，即為樣品的實際濃度。