人淋巴細(xì)胞因子ELISA試劑盒實(shí)驗(yàn)方法

產(chǎn)品名稱：人淋巴細(xì)胞因子ELISA試劑盒
英文名稱：Human lymphocyte factor ELISA Kit
試劑盒保存：保質(zhì)期六個(gè)月，保存環(huán)境2-8℃(頻繁使用時(shí))；-20℃(較長(zhǎng)時(shí)間不用時(shí))。
規(guī)格：48T/96T
檢測(cè)方法：酶聯(lián)免疫法/酶免法（ELISA）
使用范圍：僅供科研檢測(cè),不得用于臨床

ELISA試劑盒組成部分：
試劑盒組成    48 孔配置    96 孔配置保存
說(shuō)明書    1份    
封板膜    2 片（48）    2 片（96）
密封袋    1個(gè)    1個(gè)
酶標(biāo)包被板    1×48     1×96
標(biāo)準(zhǔn)品    225nmol/L 0.5ml×1 瓶    0.5ml×1 瓶
標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液    1.5ml×1 瓶    1.5ml×1 瓶
酶標(biāo)試劑    3 ml×1 瓶    6 ml×1 瓶
樣品稀釋液    3 ml×1 瓶    6 ml×1 瓶
顯色劑A液    3 ml×1 瓶    6 ml×1 瓶
顯色劑B液    3 ml×1 瓶    6 ml×1 瓶
終止液    3ml×1 瓶    6ml×1 瓶
濃縮洗滌液    （20ml×20 倍）×1 瓶    （20ml×30 倍）×1 瓶

實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備工作：
1、試劑配制:洗滌液按1:20三蒸水稀釋;標(biāo)準(zhǔn)品在用前每管加入200 ?l蒸餾水溶解即可(具體見說(shuō)明書);底物工作液應(yīng)在顯色前5-10 min將OPD片放入底物稀釋液中溶解,每片加5 ml液。
2、標(biāo)本收集:采集血清或體液盡早檢測(cè),2~8 ℃保存一天需更長(zhǎng)時(shí)間須冷凍(-20℃)保存,避免反復(fù)凍融;組織(胎肝、胎腦等)實(shí)驗(yàn)前一天組織勻漿,用90%體積RIPA裂解液(PH 8.0,50 mM Tris HCl、1% NP-40、,0.25% sodium deoxycholate、150 mM NaCl、1 mM EDTA)和10%體積的10 mM PMSF進(jìn)行組織勻漿(10%),冰上裂解30 min,12000×20min后取上清,4℃待用。
3、器材準(zhǔn)備:酶標(biāo)儀、37 ℃恒溫烤箱、濾紙、托盤、量筒、燒杯、各種規(guī)格的移液器、離心管、管架和廢液缸等。三蒸水自備。

人淋巴細(xì)胞因子ELISA試劑盒操作步驟：
1、設(shè)立標(biāo)準(zhǔn)孔8孔(根據(jù)樣品蛋白濃度可調(diào)整為6孔),每孔中先各加入樣品稀釋液100 ul,第一孔再加標(biāo)準(zhǔn)品100 ul,混勻后用移液器吸出100 ul,移至第二孔,如此反復(fù)作對(duì)倍稀釋至第7孔,最后,從第7孔中吸出100 ul棄去,使之體積均為100 ul。第8孔為空白對(duì)照。
2、加樣:待測(cè)樣品孔中每孔各加入待測(cè)樣品100ul。
3、將反應(yīng)板置于37 ℃×120 min。
4、洗板:用洗滌液將反應(yīng)板充分洗滌4-6次,向?yàn)V紙上扣干。
5、每孔中加入第一抗體工作液50ul。
6、將反應(yīng)板充分混勻后置37 ℃×60 min。
7、洗板:用洗滌液將反應(yīng)板充分洗滌4~6次,向?yàn)V紙上扣干。
8、每孔加酶標(biāo)抗體工作液100ul。
9、將反應(yīng)板置于37 ℃ 120 min。
10、洗板:用洗滌液將反應(yīng)板充分洗滌4~6次,向?yàn)V紙上扣干。
11、每孔中加入底物工作液100ul, 置于37 ℃暗處反應(yīng)5~10 min。
12、每孔中加入50ul終止液混勻。
13、用酶標(biāo)儀在492 nm處測(cè)吸光值。

計(jì)算結(jié)果與判斷：
1、以標(biāo)準(zhǔn)品 1000、500、250、125、62.5、31.25、15.625、0 pg/ml之OD值在半對(duì)數(shù)紙上作圖,畫出標(biāo)準(zhǔn)曲線。
2、所有OD值都應(yīng)減去空白管值后再計(jì)算。
根據(jù)樣品OD值在該標(biāo)準(zhǔn)曲線圖上查出或根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線公式換算出相應(yīng)樣品中TNF-a含量。

注意事項(xiàng)：
1、以上標(biāo)準(zhǔn)孔及待查樣品均建議做復(fù)孔,每次測(cè)定均要做標(biāo)準(zhǔn)孔。
2、本試劑盒宜置-20 ℃冷藏保存。
3、本人ELISA試劑盒取出的試劑在室溫(20~25 ℃)環(huán)境下使用,溶液應(yīng)輕輕搖勻后使用。
4、本試劑盒含2M硫酸,不要將它與含疊氮化鈉的廢物混在一起。
5、板條開封后剩余板條要再封好,保持板條干燥。
6、避免交叉污染。如洗滌時(shí)向樣品待測(cè)蛋白含量可能高的一側(cè)傾倒。
7、提前24 h打開烤箱預(yù)熱。
8、底物工作液應(yīng)在顯色前5~10 min配制。若配制時(shí)間過長(zhǎng),會(huì)變質(zhì)。
9、甩盡孔內(nèi)液體,每孔加350 ul左右洗滌液,靜止30 s后甩盡。尤其加抗體工作液或底物時(shí)盡量弄干孔內(nèi)液體。且孵育過程中要蓋住各反應(yīng)孔,防止液體恢復(fù)。
10、盡量防止樣品待測(cè)蛋白濃度過高而出現(xiàn)酶標(biāo)儀顯示out。當(dāng)酶標(biāo)儀測(cè)定值出現(xiàn)許多out時(shí),可通過稀釋一定倍數(shù)后用可見光分光計(jì)測(cè)定,所有孔均同時(shí)測(cè)定.