分光光度法基本原理及應(yīng)用說(shuō)明

分光光度的概述
吸光光度法定義:
基于物質(zhì)對(duì)光的選擇性吸收而建立的分析方法稱為吸光光度法，包括紫外可見(jiàn)分光光度法及紅外光譜法等。
紫外可見(jiàn)分光光度法所用的光譜區(qū)域?yàn)?00~780nm，其中紫外分光光度法為200~400nm，可見(jiàn)分光光度法為400~ 780nm。
紅外光譜法為2.5~1000um。

分光光度法概述
分光光度法的發(fā)展歷程:
最初人們發(fā)現(xiàn)很多物質(zhì)都具有顏色，例如Mn04-為紫紅色，F(xiàn)e3+為黃色，當(dāng)含有這些物質(zhì)的溶液濃度改變時(shí)，溶液顏色的深淺度也就隨著改變。溶液越濃顏色越深，溶液越稀顏色越淺，因此利用比較溶液顏色深淺的方法來(lái)確定溶液中有色物質(zhì)的含量，這種方法稱為“目視比色法”，隨后人們又認(rèn)識(shí)到溶液的顏色是由于對(duì)光的選擇性吸收而產(chǎn)生的，可以利用濾光片和光電池客觀的測(cè)量溶液的濃度，從而出現(xiàn)了“光電比色法”。隨著近代測(cè)試儀器的發(fā)展，用分光光度計(jì)代替比色計(jì)，出現(xiàn)了分光光度法。

分光光度法基本原理
溶液顏色與光吸收的關(guān)系日常所見(jiàn)的白光，如日光、白熾燈光，都是混合光，即它們是由波長(zhǎng)400~780nm的電磁波按適當(dāng)強(qiáng)度比例混合而成的，這段波長(zhǎng)范圍的光是人們視覺(jué)可覺(jué)察到的，所以稱為可見(jiàn)光。當(dāng)電磁波的波長(zhǎng)小于400nm時(shí)稱為紫外光，大于780nm的稱為紅外光，都是人們視覺(jué)覺(jué)察不到的光?；パa(bǔ)色光:當(dāng)將某兩種顏色的光按適當(dāng)強(qiáng)度比例混合時(shí)，可以形成白光，這兩種色光就稱為互補(bǔ)色光。

當(dāng)一束白光(混合光)通過(guò)某溶液時(shí)，如果該溶液對(duì)可見(jiàn)光區(qū)各種波長(zhǎng)的光都沒(méi)有吸收，即入射光全部通過(guò)溶液，則溶液呈無(wú)色透明狀。
當(dāng)該溶液對(duì)可見(jiàn)光區(qū)各種波長(zhǎng)的光全部吸收時(shí)，則該溶液呈黑色。

如某溶液對(duì)可見(jiàn)光區(qū)某種波長(zhǎng)的光選擇性地吸收，則該溶液即呈現(xiàn)出被吸收波長(zhǎng)光的互補(bǔ)色光的顏色。
例如當(dāng)一束白光通過(guò)KMnO4溶液時(shí)，該溶液選擇性的吸收了綠色波長(zhǎng)的光，而將其它的色光兩兩互補(bǔ)成白光而通過(guò)去，只剩下紫色光未被互補(bǔ)，所以KMnO4溶液呈現(xiàn)紫色。

光吸收曲線
光吸收曲線:將不同波長(zhǎng)的光依次通過(guò)某一定濃度和一定厚度的溶液，分別測(cè)出它對(duì)各種波長(zhǎng)光的吸光度，以波長(zhǎng)為橫坐標(biāo)，以吸光度為縱坐標(biāo)繪制成的曲線(亦稱吸收光譜)最大吸收波長(zhǎng)(Aμaξ) :在吸收曲線上吸收峰最大處所對(duì)應(yīng)的波長(zhǎng)。

標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制
配制一系列不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液，在一定條件下顯色，使用同樣厚度的吸收池，測(cè)定吸光度，上然后以濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)作圖，得一條直線，在同樣條件下測(cè)出試樣溶液的吸光度就可以從工作曲線上查出試樣溶液的濃度。但在實(shí)際工作中經(jīng)常發(fā)現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)曲線不成直線的情況，特別是當(dāng)吸光物質(zhì)的濃度高時(shí)，明顯的向上或向下偏離標(biāo)準(zhǔn)曲線，這種情況稱為偏離朗伯-比耳定律現(xiàn)象。

引起偏離朗伯-比爾定律的原因
(1)入射光為非單色光。嚴(yán)格講朗伯-比耳定律只適用于單色光。應(yīng)選用Aμaξ處或肩峰處測(cè)定。
(2)溶液中的化學(xué)反應(yīng)。離解、絡(luò)合、締合會(huì)破壞線性關(guān)系，應(yīng)控制條件(酸度、濃度、介質(zhì)等)。
(3)比耳定律的局限性引起偏離。嚴(yán)格說(shuō)，比耳定律是一個(gè)有限定律，它只適用于濃度小于0.01mol/L的稀溶液。