流式細(xì)胞術(shù)實(shí)驗(yàn)步驟

流式細(xì)胞術(shù)（flowcytometry，F(xiàn)CM）是一種綜合應(yīng)用光學(xué)、機(jī)械學(xué)、流體力學(xué)、電子計(jì)算機(jī)、細(xì)胞生物學(xué)、分子免疫學(xué)等學(xué)科技術(shù)，使被測(cè)溶液流經(jīng)測(cè)量區(qū)域，并逐一檢測(cè)其中每一個(gè)細(xì)胞的物理和化學(xué)特性，從而對(duì)高速流動(dòng)的細(xì)胞或亞細(xì)胞進(jìn)行快速定量測(cè)定和分析的方法。

首先，待測(cè)細(xì)胞經(jīng)處理或染色后被壓人流動(dòng)室，與此同時(shí)，不含細(xì)胞的緩沖液在高壓下從鞘液管噴出，鞘液管人口方向與待測(cè)樣品流成一定角度，這樣鞘液就能被包繞著樣品高速流動(dòng)，組成一個(gè)圓形的流束，待測(cè)細(xì)胞在包繞下單行排列，依次通過(guò)檢測(cè)區(qū)域。在激光束的照射下產(chǎn)生散射光和激發(fā)熒光。這兩個(gè)光源信號(hào)分別反映了細(xì)胞體積的大小和內(nèi)部的信息。經(jīng)光電倍增管接收后可轉(zhuǎn)換為電信號(hào)，再通過(guò)模，數(shù)轉(zhuǎn)換器。將連續(xù)的電信號(hào)轉(zhuǎn)換為可被計(jì)算機(jī)識(shí)別的數(shù)字信號(hào)，經(jīng)計(jì)算機(jī)處理，可將分析結(jié)果顯示在屏幕上。

為了保證細(xì)胞單個(gè)排列地逐一通過(guò)檢測(cè)區(qū)域，鞘流技術(shù)在流式細(xì)胞術(shù)中被廣泛應(yīng)用。根據(jù)層流理論，由于兩種液體的流速和壓力不同。在一定條件下樣品溶液與包裹它的鞘液在流動(dòng)中可以保持相互分離并且同軸。同時(shí)鞘液流可以加速樣品溶液中顆粒的流動(dòng)并迫使他們的流動(dòng)軌跡保持在液流的中軸線上，使細(xì)胞單排列地逐一通過(guò)檢測(cè)區(qū)域，這便是所謂的液流聚焦原理。
流式細(xì)胞術(shù)實(shí)驗(yàn)：

1、制備細(xì)胞懸液，計(jì)數(shù)

2、分裝，按照每個(gè)EP（1.5ml）管1-2*10 6個(gè)細(xì)胞分裝，3500rpm，4度離心。

3、用100ulPBS重懸，加入10ul大鼠血清封閉，4度避光30min。

4、加入相應(yīng)的熒光標(biāo)記的抗體，混勻，避光，4度孵育30min。

5、加入1mlPBS洗兩遍。

6、用200ul PBS重懸，經(jīng)紗布過(guò)濾轉(zhuǎn)至流式管，上級(jí)檢測(cè)。

細(xì)胞或者大小接近的顆粒物質(zhì)都可以檢測(cè)。

樣本通過(guò)鞘液的輸送，成單個(gè)隊(duì)列依次通過(guò)激光束。樣本事先可以根據(jù)檢測(cè)需要被熒光標(biāo)記，通過(guò)激光束的時(shí)候就會(huì)得到熒光信號(hào)，被記錄下來(lái)。可以同時(shí)標(biāo)記不同的熒光標(biāo)記做不同的檢查。優(yōu)點(diǎn)就是可以在短時(shí)間內(nèi)檢測(cè)大量的樣本（每秒幾千個(gè)到幾萬(wàn)個(gè)細(xì)胞）。

主要應(yīng)用于各種生物醫(yī)學(xué)研究和臨床診斷。國(guó)際上通用的白細(xì)胞和淋巴瘤的診斷標(biāo)準(zhǔn)就是靠流式細(xì)胞儀的分型來(lái)確定的。