使用流式檢測細(xì)胞凋亡過程介紹

細(xì)胞凋亡通常稱為細(xì)胞程序性死亡，是由基因控制的主動(dòng)性細(xì)胞死亡過程。越來越多數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞凋亡與多種疾病密切相關(guān)，如癌細(xì)胞具有連續(xù)增殖、抵抗細(xì)胞凋亡能力，利用流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞凋亡可為腫瘤診斷，療效評價(jià)和預(yù)后預(yù)測提供了重要的參考指標(biāo)。然而很多實(shí)驗(yàn)的同學(xué)們，常會(huì)碰到上機(jī)檢測時(shí)細(xì)胞死亡太多卻檢測不出凋亡，多次重復(fù)結(jié)果不一致等現(xiàn)象，接下來就一起看看如何把細(xì)胞凋亡的數(shù)據(jù)變的更加漂亮，準(zhǔn)確！ 首先，明確一下細(xì)胞凋亡和壞死的區(qū)別

細(xì)胞凋亡(apoptosis) 是一件主動(dòng)性細(xì)胞死亡事件，它涉及一系列基因的激活、表達(dá)以及調(diào)控，是細(xì)胞為更好地適應(yīng)環(huán)境而主動(dòng)爭取的一種死亡過程。 具體表現(xiàn)為： 出芽形成凋亡小體、核小體間DNA的切割，凋亡小體被吞噬和消化等幾個(gè)連續(xù)過程等。

細(xì)胞壞死（necrosis） 則是一件被動(dòng)的過程，是細(xì)胞受到強(qiáng)烈理化或生物因素作用引起細(xì)胞無序變化的死亡過程，即病理?xiàng)l件下，自體損傷的一種現(xiàn)象。 具體表現(xiàn)為： 細(xì)胞脹大，胞膜破裂，細(xì)胞內(nèi)容物外溢，核變化較慢，DNA降解不充分，會(huì)引起局部嚴(yán)重的炎癥反應(yīng)。

流式檢測細(xì)胞凋亡的原理

Annexin V和PI雙染法是流式檢測細(xì)胞凋亡的經(jīng)典方法 ，它是基于凋亡的早期細(xì)胞膜上的磷脂酰絲氨酸（phosphotidylserine, PS）從細(xì)胞膜的內(nèi)側(cè)翻轉(zhuǎn)到細(xì)胞膜的表面這一原理來實(shí)現(xiàn)的。

凋亡早期 PS從細(xì)胞膜的內(nèi)側(cè)外翻：該方法簡便、快速、準(zhǔn)確區(qū)分活細(xì)胞、凋亡細(xì)胞和壞死細(xì)胞。因此，將Annexin V與PI聯(lián)合使用時(shí)，便可用來鑒別活細(xì)胞，凋亡細(xì)胞及死亡細(xì)胞。

數(shù)據(jù)分析

Annexin V-FITC/PI凋亡檢測試劑盒是用FITC標(biāo)記的Annexin V作為探針，F(xiàn)ITC最大激發(fā)波長為488 nm，最大發(fā)射波長525 nm，F(xiàn)ITC的綠色熒光在FL1通道檢測；PI-DNA復(fù)合物的最大激發(fā)波長為535 nm，最大發(fā)射波長為615 nm，PI的紅色熒光在FL2或FL3通道檢測。通過軟件分析，繪制雙色散點(diǎn)圖，F(xiàn)ITC為橫坐標(biāo)，PI為縱坐標(biāo)。

常見問題解答

1. 如何避免出現(xiàn)假陽性結(jié)果？

2. 為什么必須收集細(xì)胞上清？

因?yàn)榈蛲龅募?xì)胞可能會(huì)脫壁，懸浮于培養(yǎng)基，所以必須收集上清再離心取沉淀，合并胰酶消化下來的細(xì)胞，不然檢測出來的凋亡比例可能會(huì)減少。

3. 為什么在染色后1h內(nèi)就要上機(jī)檢測？

由于細(xì)胞凋亡是一個(gè)快速的過程，建議樣品在染色后1小時(shí)之內(nèi)進(jìn)行分析；PI受時(shí)間的影響很大，因標(biāo)記了PI后會(huì)加大細(xì)胞毒性，特別是檢測早期凋亡時(shí)，如果時(shí)間延長除了會(huì)導(dǎo)致在流式細(xì)胞儀上的細(xì)胞分群差距加大外，誤差會(huì)明顯加大，所以建議在一個(gè)小時(shí)內(nèi)檢測。