大腸桿菌質(zhì)粒DNA的提取步驟

質(zhì)粒DNA的提取是從事基因工程工作中的一項基本實驗技術(shù)，但提取方法有很多種，以下介紹一種最常用的方法：

堿裂解法：此方法適用于小量質(zhì)粒DNA的提取，提取的質(zhì)粒DNA可直接用于酶切、PCR擴增、銀染序列分析。方法如下：

1、接1%含質(zhì)粒的大腸桿菌細胞于2ml LB培養(yǎng)基。

2、37℃振蕩培養(yǎng)過夜。

3、取1.5ml菌體于Ep管，以4000rpm離心3min，棄上清液。

4、加0.lml溶液I(1%葡萄糖，50mM/L EDTA pH8.0，25mM/L Tris-HCl pH8.0)充分混合。

5、加入0.2ml溶液 II(0.2 mM/L NaOH，1% SDS)，輕輕翻轉(zhuǎn)混勻，置于冰浴5 min 。

6、加入0.15m1預冷溶液III(5 mol/L KAc，pH4.8)，輕輕翻轉(zhuǎn)混勻，置于冰浴5 min 。

7、以10，000rpm離心20min，取上清液于另一新Ep管

8、加入等體積的異戊醇，混勻后于0℃靜置10min。

9、再以10，000rpm離心20min，棄上清。

10、用70%乙醇0．5ml洗滌一次，抽干所有液體。

11、待沉淀干燥后，溶于0．05mlTE緩沖液中。

煮沸法

1、將1.5ml培養(yǎng)液倒入eppendorf管中，4℃下12000ｇ離心30秒。

2、棄上清，將管倒置于衛(wèi)生紙上幾分鐘，使液體流盡。

3、將菌體沉淀懸浮于120ml STET溶液中，渦旋混勻。

4、加入10ml新配制的溶菌酶溶液(10mg/ml)，渦旋振蕩3秒鐘。

5、將eppendorf管放入沸水浴中，50秒后立即取出。

6、用微量離心機4℃下12000g離心10分鐘。

7、用無菌牙簽從eppendorf管中去除細菌碎片。

8、取20ml進行電泳檢查。

注意：

1. 對大腸桿菌可從固體培養(yǎng)基上挑取單個菌落直接進行煮沸法提取質(zhì)粒DNA。

2. 煮沸法中添加溶菌酶有一定限度，濃度高時，細菌裂解效果反而不好。有時不同溶菌酶也能溶菌。

3. 提取的質(zhì)粒DNA中會含有RNA，但RNA并不干擾進一步實驗，如限制性內(nèi)切酶消化，亞克隆及連接反應等。