蛋白質(zhì)糖基化位點檢測實驗步驟

蛋白質(zhì)糖基化位點檢測：用酶或化學(xué)脫糖基化、通過選擇性標(biāo)記或通過凝集素親和層析法是檢測蛋白糖基化常用方法。

一、用 PNGaseF（N-多糖酶）處理。

1. 以 0.1 mol/L 磷酸鈉（或 Tris-HCl，而不用檸檬酸）緩沖液，pH 7.4 ( 7.0~8.0 ) 配制高達(dá) 2 mg/ml 的蛋白溶液，并含 50 mmol/L β-巰基乙醇和 0.1% SDS，在水浴中煮沸 2 分鐘。

2. 加 1/10 體積的 10% NP-40 溶液（或使 SDS 濃度少于或等于 0.17%，NP-40：SDS 的質(zhì)量比在終反應(yīng)中至少是 7:1)。

3. 加 PNGaseF 到終濃度為 6 mU/ml。注意這里的 1U 相當(dāng)于在 1 分鐘形成的 1 微摩爾產(chǎn)物；--些廠家用 1U = 1 nmole/分 在 37℃ 中保溫 16 小時，以完全脫糖基化。

4. 用 TCA/DOC 按照下列步驟沉淀以制備 SDS-PAGE 樣品。

(1) 在樣品中加等體積的含 50% TCA 的 10 mmol/L DOC 溶液，并且在冰上放置 20 分鐘。

(2) 以最大速度（16000 g)，4℃ 下離心樣品 15 分鐘。

(3) 用冷丙酮清洗沉淀一次，并再次離心樣品。

(4) 用 SDS-PAGE 樣本緩沖液重懸最后的沉淀，如有必要，可用小體積的 1 mol/L Tris pH 8.0。將懸液調(diào)至 pH 8.0 樣品上樣至凝膠上進(jìn)行電泳。

二、用 EndoH 處理

1. 在 100 mmol/L、pH 5.5 的檸檬酸鈉緩沖液中制備濃度達(dá)到 1 mg/ml 的蛋白樣品。

2. 用 10 mU/ml 酶 37℃ 消化樣品過夜。

3. 按常規(guī)的方法處理樣品用于 SDS-PAGE 分析。

三、酶去除 O -多糖

1. 二甲胂酸鈉（磷酸鹽或馬來酸鹽，但不是 Tris-HCl ) 中制備濃度 5 mg/ml 的蛋白，pH 6~7.6。

2. 用 10 mU/ml 的酶消化樣品，在 37℃ 孵育過夜。

3. 按照 PNGaseF 第 4 步所述的方法（TCA/DOC 沉淀）處理反應(yīng)混合物以進(jìn)行 SDS-PAGE。

四、來自產(chǎn)脲節(jié)桿菌的唾液酸苷酶

1. 以 pH 5.0、50 mmol/L 醋酸鈉制備 0.5 mg/ml 的蛋白溶液。

2. 加 10 mU/ml 的唾液酸苷酶，37℃ 下保溫 12~16 小時。

3. 制備樣品用于 SDS-PAGE 分析。