PCR基因擴增原理和基本程序

基因擴增技術(shù)（PCR）聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction簡稱PCR）又稱無細胞分子克隆系統(tǒng)或特異性DNA序列體外引物定向酶促擴增法，是基因擴增技術(shù)的一次重大革新?？蓪O微量的靶DNA特異地擴增上百萬倍，從而大大提高對DNA分子的分析和檢測能力，能檢測單分子DNA或?qū)γ?0萬個細胞中僅含1個靶DNA分子的樣品，因而此方法立即在分子生物學(xué)、微生物學(xué)、醫(yī)學(xué)及遺傳學(xué)等多領(lǐng)域廣泛應(yīng)用和迅速發(fā)展。由于PCR具有敏感性高、特異性強、快速、簡便等優(yōu)點，已在病原微生物學(xué)領(lǐng)域中顯示出巨大的應(yīng)用價值和廣闊的發(fā)展前景。

PCR技術(shù)是由Cetus公司和加利福尼亞大學(xué)1985年聯(lián)合創(chuàng)造的，主要貢獻者為Kary B mulis和HeneryA、Erlich。該方法首先被應(yīng)用于人β-珠蛋白DNA的擴增及鐮刀狀紅細胞貧血病的產(chǎn)前診斷。自85年首次報道PCR方法以來，PCR被廣泛應(yīng)用于分子克隆、序列分析、基因突變、遺傳病、傳染病、性傳播性疾病及法醫(yī)判定和考古研究等多領(lǐng)域、并發(fā)揮了越來越大的作用。因而發(fā)明人Kary B、mulis獲1993年諾貝爾化學(xué)獎。

為了使PCR技術(shù)在臨床上迅速得以普及，我們對該技術(shù)的某些程序成功地作了重大改革，使PCR技術(shù)變得簡單、微量化、不易發(fā)生污染，從而使PCR技術(shù)常規(guī)化成為可能。我們的方法迅速在全國各大醫(yī)院得到推廣。
一、PCR的基本原理和基本程序

PCR擴增DNA的原理是：先將含有所需擴增分析序列的靶DNA雙鏈經(jīng)熱變性處理解開為兩個寡聚核苷酸單鏈，然后加入一對根據(jù)已知DNA序列由人工合成的與所擴增的DNA兩端鄰近序列互補的寡聚核苷酸片段作為引物，即左右引物。此引物范圍就在包括所欲擴增的DNA片段，一般需20-30個堿基對，過少則難保持與DNA單鏈的結(jié)合。引物與互補DNA結(jié)合后，以靶DNA單鏈為模板，經(jīng)反鏈雜交復(fù)性（退火），在Taq DNA聚合酶的作用下以4種三磷酸脫氧核苷（dNTP）為原料按5'到3'方向?qū)⒁镅由?、自動合成新的DNA鏈、使DNA重新復(fù)制成雙鏈。然后又開始第二次循環(huán)擴增。引物在反應(yīng)中不僅起引導(dǎo)作用，而且起著特異性的限制擴增DNA片段范圍大小的作用。新合成的DNA鏈含有引物的互補序列，并又可作為下一輪聚合反應(yīng)的模板。如此重復(fù)上述DNA模板加熱變性雙鏈解開—引物退火復(fù)性—在DNA聚合酶作用下的引物延伸的循環(huán)過程，使每次循環(huán)延伸的模板又增加1倍，亦即擴增DNA產(chǎn)物增加1倍，經(jīng)反復(fù)循環(huán)，使靶DNA片段指數(shù)性擴增。

PCR的擴增倍數(shù)Y=（1+E）n,這里Y是擴增量，n為PCR的循環(huán)次數(shù)。E為PCR循環(huán)擴增效率。設(shè)PCR擴增效率E為100%、循環(huán)次數(shù)n=25次，靶DNA將擴增到33554432個拷貝，即擴增3355萬倍：若E為80%、n=20、則擴增數(shù)量將下降到1408865拷貝，即擴增產(chǎn)物約丟失93%，若E=100%，n=20，則擴增數(shù)量減少1048576個拷貝，擴增產(chǎn)物約減少97%?？梢奝CR循環(huán)擴增效率及循環(huán)次數(shù)都對擴增數(shù)量有很大影響。PCR擴增屬于酶促反應(yīng)，所以，DNA擴增過程遵循酶促動力學(xué)原理。靶DNA片段的擴增最初表現(xiàn)為直線上升，隨著靶DNA片段的逐漸積累，當(dāng)引物—模板/DNA/聚合酶達到一定比值時，酶的促化反應(yīng)趨于飽和，此時靶DNA產(chǎn)物的濃度不再增加，即出現(xiàn)所謂平臺效應(yīng)。PCR反應(yīng)達到平臺期的時間主要取決于反應(yīng)開始時樣品中的靶DNA的含量和擴增效率，起始模板量越多到達平臺期的時間就越短、擴增效率越高到達平臺期的時間也越短。另外酶的含量，dNTp 濃度，非特異性產(chǎn)物的擴增都對到達平臺期時間有影響。

二、PCR的特點

（一）特異性高：首次報導(dǎo)的PCR所用的DNA聚合酶是大腸桿菌的DNAPolymerase I的Klenow大片段，其酶活性在90℃會變性失活，需每次PCR循環(huán)都要重新加入Klenow大片段，同時引物是在37℃延伸（聚合）易產(chǎn)生模板—引物之間的堿基錯配、致特異性較差，1988年Saiki等從溫泉水中分離到的水生嗜熱桿菌中提取的熱穩(wěn)定的Taq DNA聚合酶，在熱變性處理時不被滅活，不必在每次循環(huán)擴增中再加入新酶，可以在較高溫度下連續(xù)反應(yīng)，顯著地提高PCR產(chǎn)物的特異性，序列分析證明其擴增的DNA序列與原模板DNA一致。擴增過程中，單核苷酸的錯誤參入程度很低、其錯配率一般只有約萬分之一，足可以提供特異性分析，選用各型病毒相對的特異寡核苷酸引物。PCR能一次確定病毒的多重感染。如用HPV11和HPV16型病毒引物檢測病婦宮頸刮片細胞可以發(fā)現(xiàn)部分病人存在HPV11和HPV16兩型的雙重感染。

（二）高度敏感：理論上PCR可以按2n倍數(shù)擴增DNA十億倍以上，實際應(yīng)用已證實可以將極微量的靶DNA成百萬倍以上地擴增到足夠檢測分析量的DNA。能從100萬個細胞中檢出一個靶細胞，或?qū)χT如病人口液等只含一個感染細胞的標(biāo)本或僅含0.01pg的感染細胞的特異性片段樣品中均可檢測。

（三）快速及無放射性：一般在2小時內(nèi)約可完成30次以上的循環(huán)擴增，加上用電泳分析。只需3-4小時便可完成，不用分離提純病毒，DNA粗制品及總RNA均可作為反應(yīng)起始物，可直接用臨床標(biāo)本如血液、體液、尿液、洗液、脫落毛發(fā)、細胞、活體組織等粗制的DNA的提取液來擴增檢測，省去費時繁雜的提純程序，擴增產(chǎn)物用一般電泳分析即可，不一定用同位素，無放射性易于推廣。

（四）簡便：擴增產(chǎn)物可直接供作序列分析和分子克隆，擺脫繁瑣的基因方法，可直接從RNA或染色體DNA中或部分DNA已降解的樣品中分離目的基因，省去常規(guī)方法中須先進行克隆后再作序列分析的冗繁程序。已固定的和包埋的組織或切片亦可檢測。如在PCR引物端事先構(gòu)建一個內(nèi)切酶位點，擴增的靶DNA可直接克隆到M13，PUC19等相應(yīng)酶切位點的載體中。

（五）可擴增RNA或cDNA：先按通常方法用寡脫氧胸苷引物和逆轉(zhuǎn)錄酶將mRNA轉(zhuǎn)變成單鏈cDNA，再將得到的單鏈cDNA進行PCR擴增，即使mRNA轉(zhuǎn)錄片段只有100ngcDNA中的0.01%，也能經(jīng)PCR擴增1ng有242堿基對長度的特異片段，有些外顯子分散在一段很長的DNA中，難以將整段DNA大分子擴增和做序列分析。若以mRNA作模板，則可將外顯子集中，用PCR一次便完成對外顯子的擴增并進行序列分析。