常用蛋白質(zhì)染色法原理及優(yōu)缺點(diǎn)

凝膠電泳是研究蛋白質(zhì)性質(zhì)的一種相對(duì)簡單、快速和高靈敏度的工具。它是分析化學(xué)、生物化學(xué)和分子生物學(xué)的主要工具。通過電泳分離蛋白質(zhì)是基于這樣一個(gè)事實(shí)，即帶電分子將在施加電場時(shí)通過基質(zhì)遷移。蛋白質(zhì)電泳分離的基質(zhì)是聚丙烯酰胺。用于形成聚丙烯酰胺的化學(xué)試劑是單體丙烯酰胺和N，N'-雙丙烯酰胺（雙-丙烯酰胺）。聚合丙烯酰胺和雙丙烯酰的方法是使用TEMED（四*基乙二胺）和過硫酸銨。聚丙烯酰胺凝膠內(nèi)部的聚合形成了一個(gè)交聯(lián)的微孔網(wǎng)絡(luò)。這種孔隙網(wǎng)絡(luò)允許小蛋白質(zhì)分子快速通過，同時(shí)減緩較大蛋白質(zhì)的遷移，這導(dǎo)致蛋白質(zhì)基于其分子大小實(shí)現(xiàn)分離。凝膠電泳是一種檢測(cè)蛋白質(zhì)純度、評(píng)估蛋白質(zhì)分子量的強(qiáng)有力的生化分析方法。在電泳系統(tǒng)中,蛋白條帶染色是一個(gè)重要的步驟，因?yàn)樗苯雨P(guān)系到試驗(yàn)結(jié)果能否使用。目前，常用的蛋白質(zhì)染色方法主要有考馬斯亮藍(lán)染色法、銀染法、負(fù)染法和熒光染色法。
考馬斯亮藍(lán)染色法

發(fā)展歷史：1963 年 Fazekas 等首次將考馬斯亮藍(lán)R-250應(yīng)用到醋酸纖維素膜上的蛋白質(zhì)染色。1965年Meyer等人將該方法用于聚丙烯酰胺凝膠電泳中蛋白的染色，其檢測(cè)靈敏度約為200~500ng。隨后考馬斯亮藍(lán)染色法逐漸被推廣使用，現(xiàn)已成為各實(shí)驗(yàn)室必備的檢測(cè)方法。染色原理：考馬斯亮藍(lán)是二磺酸化的三苯甲烷類染料，在酸性條件下，該染料可通過磺酸基和蛋白質(zhì)分子上質(zhì)子化的堿性氨基酸間通過靜電相互作用相結(jié)合。其次，該染料還可以通過其疏水性基團(tuán)(苯環(huán))和蛋白質(zhì)的疏水性區(qū)域產(chǎn)生疏水作用力，同時(shí)該染料和蛋白還存在氧鍵和范德華力的作用。

目前廣泛用的考馬斯亮藍(lán)有G-250和R-250兩種，R-250比G-250少2個(gè)甲基。游離狀態(tài)的考馬斯亮藍(lán)G250在酸性溶液中呈藍(lán)偏綠色，與蛋白質(zhì)結(jié)合后呈藍(lán)色，考馬斯亮藍(lán)G-250由于與蛋白質(zhì)的結(jié)合反應(yīng)十分迅速，常用于蛋白質(zhì)含量的測(cè)定，也可染膠，但脫色較慢較難?？捡R斯亮藍(lán)R-250呈藍(lán)色，有輕微紅色，與蛋白質(zhì)反應(yīng)雖然比較緩慢，但是可以被洗脫下去，所以常用來對(duì)電泳條帶染色。

考馬斯亮藍(lán)染色法的優(yōu)點(diǎn)：由于考馬斯亮藍(lán)具有成本低、操作便捷及質(zhì)譜兼容性好等特點(diǎn)，使得該類染料成為最常用的蛋白質(zhì)染色染料。考馬斯亮藍(lán)染色法的缺點(diǎn)：染色靈敏度低，約為幾十納克到幾微克，對(duì)低豐度蛋白質(zhì)的顯色較差；染色時(shí)間長，并且凝膠有比較深的背景，需要較長時(shí)間的脫色，實(shí)驗(yàn)時(shí)間較長；由于染色和脫色過程中會(huì)使用到甲醇和冰乙酸等有毒或有刺激性氣味試劑，對(duì)身體健康有害。

銀染法

發(fā)展歷史：1979年，Switzer等發(fā)明了更靈敏的銀染色方法，該方法比考馬斯亮藍(lán)染色靈敏高出2個(gè)數(shù)量級(jí)，它可以檢測(cè)小至0.38ng/mm2的牛血清白蛋白。

銀染法的原理：在溶液條件下銀離子能與蛋白質(zhì)的天冬氨酸和谷氨酸上的羧基通過靜電力相結(jié)合，同時(shí)銀離子還可與組氨酸、蛋氨酸、半胱氨酸和賴氨酸上的咪唑、甲硫基、巰基和氨基結(jié)合；接著，在堿性條件下，與蛋白質(zhì)結(jié)合的銀離子在甲醛等還原劑的還原作用下生成黑褐色的金屬銀使蛋白質(zhì)顯色。

銀染法優(yōu)點(diǎn)：靈敏度高，可以檢測(cè)到0.25~1ng的蛋白質(zhì)，適用于低豐度蛋白質(zhì)染色。

銀染法缺點(diǎn)：甲醛的使用讓凝膠中蛋白化學(xué)交聯(lián)，導(dǎo)致質(zhì)譜不兼容；線性范圍窄，不太適合量化；染色步驟復(fù)雜，染色過程污染較大，費(fèi)時(shí)費(fèi)力(需要8～16h)；試劑成本較高，需要接觸有毒的甲醛；而且,核酸、脂多糖、脂類、醣脂類化合物常會(huì)對(duì)銀染染色的結(jié)果進(jìn)行干擾，導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)重復(fù)率低。

負(fù)染法

1987年，LeeC等首次發(fā)明了蛋白質(zhì)銅負(fù)染法，只需五分鐘即可SDS-PAGE凝膠上清晰顯示6-10ng蛋白質(zhì)條帶。

蛋白質(zhì)負(fù)染法的原理是：將金屬離子有選擇地沉淀在膠面上，而蛋白質(zhì)條帶不被染色。因此，蛋白質(zhì)所處區(qū)域是透明的，從而達(dá)到檢測(cè)目的。該方法主要包括氯化鉀負(fù)染法、氯化銅負(fù)染法、氯化鋅負(fù)染法、氯化鎳負(fù)染法、醋酸鹽負(fù)染法和咪唑鋅負(fù)染法等。

負(fù)染法的優(yōu)點(diǎn)：操作便捷，成本較低。咪唑鋅負(fù)染靈敏度接近于銀染法(1～10ng)，蛋白質(zhì)與鋅和咪唑的結(jié)合是可以逆轉(zhuǎn)的，洗脫后的蛋白質(zhì)化學(xué)性質(zhì)沒有改變，因而具有良好的質(zhì)譜兼容性。

負(fù)染法的缺點(diǎn)：對(duì)比度較差，重現(xiàn)性容易受到多種物理化學(xué)因素的影響(例如染色液的pH、溫度，膠中陰離子的濃度等)，從而限制本方法的廣泛使用。

熒光染色法

針對(duì)考馬斯亮蘭染色雖然快速但是靈敏度不夠，銀染法雖然靈敏度高但是背景較高，結(jié)果容易受到核酸，脂類的污染等缺點(diǎn),人們開始使用熒光染料對(duì)凝膠中的蛋白質(zhì)條帶進(jìn)行染色。

熒光染色法原理是：熒光染料通過靜電作用與SDS包裹的質(zhì)子化蛋白質(zhì)相結(jié)合，搭配熒光掃描儀成像來檢測(cè)蛋白。

熒光染色法的優(yōu)點(diǎn)：蛋白質(zhì)熒光染色法具有線性范圍廣,靈敏度高(1~100ng／band)，質(zhì)譜兼容性好，適用于高通量蛋白質(zhì)組學(xué)的研究。

熒光染色法的缺點(diǎn)：會(huì)用到強(qiáng)烈氣味和刺激性的試劑，使用的試劑一般價(jià)格比較昂貴；熒光染色一般需要相對(duì)較長的處理時(shí)間，并且需要配備熒光成像掃描儀之類的特殊設(shè)備；熒光染料標(biāo)記蛋白后會(huì)改變其在凝膠中的遷移性質(zhì)，不同蛋白質(zhì)樣品含有與熒光染料反應(yīng)的氨基殘基不同，導(dǎo)致最終檢測(cè)到的信號(hào)差別比較大；電泳前進(jìn)行染料標(biāo)記容易使蛋白質(zhì)形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)，造成蛋白質(zhì)從凝膠向硝酸纖維素濾膜上轉(zhuǎn)移時(shí)出現(xiàn)障礙；此外，熒光染料的化學(xué)穩(wěn)定性相對(duì)較差、光漂白和光降解現(xiàn)象比較嚴(yán)重。以上因素導(dǎo)致該方法的普及和使用率較低。